Součást výstupu V009 v rámci projektu NAZV QF4133
„Tvorba výchozích šlechtitelských materiálů s geny horizontální rezistence k plísni bramborové“
Autorský kolektiv:
Ing. Marie Greplová
Mgr. Hana Polzerová
Ing. Jaroslava Domkářová, Ph.D., MBA
1 Úvod
Kulturní brambor (Solanum tuberosum L., 2n=4x=48) je vegetativně množený druh s tetrasomickou dědičností a vysokou úrovní heterozygotnosti (Tai and Xiong 2005). Variabilita mezi odrůdami je omezená díky těsné příbuznosti. Zdrojem alelické diversity jsou tedy plané druhy rodu Solanum, které nesou cenné vlastnosti včetně rezistencí k abiotickým a biotickým stresům (Cardi et al. 1993, Helgeson and Haberlach 1999). Rod Solanum je modelovým systémem se silným mechanismem sexuální izolovanosti zejména díky “efektivní” ploidii (EBN – Endosperm ballance Number) (Carputo et al. 1997). Diploidní (2n = 2x = 24) plané druhy Solanum s EBN = 1 jsou sexuálně izolované od diploidních 2EBN druhů, tetraploidů (2n = 4x = 48, 4EBN) a dihaploidů (2n=2x=24, 2EBN) S. tuberosum. Tyto bariéry křížitelnosti mohou být překlenuty zvýšením nebo snížením úrovně ploidie (Carputo et al. 1997).
Metodou pro zvýšení úrovně ploidie je polyploidizace pomocí umělého zdvojení počtu chromozómů. Je možno ji provádět cestou in vivo i in vitro aplikace. Aplikace in vitro je v současné době upřednostňována. Účinné látky jsou aplikovány přímo do kultivačního média (Eeckhaut et al. 2004, de Carvalho et al. 2005) nebo jako vodní roztoky na nodální segmenty (Escandón et al. 2006). Mezi účinné látky působící jako toxiny mitotického vřeténka patří kolchicin, oryzalin, trifluralin nebo amiprophos-methyl (Hancock 1997, van Tuyl et al. 1992, Doležel et al. 1994, Hansen and Andersen 1996, Hansen et al. 2000).
Předkládaná metodika je inovovaným postupem kombinujícím dosud používané metody in vitro a týká se aplikace kolchicinu a oryzalinu. Hansen a Andersen (1996) uvádí, že kolchicin je obecně méně účinný než některé herbicidy (oryzalin) s antimirktotulární aktivitou, které vykazují vyšší afinitu k rostlinnému tubulinu. Při práci s oryzalinem se snižuje zdravotní riziko pro personál laboratoře. Vždy je nezbytné dodržet všechna bezpečnostní opatření dle platných předpisů.
2 Metodický postup
Předkládaný metodický postup mitotické polyploidizace in vitro vyžaduje dostatek vhodného rostlinného materiálu pro přípravu nodálních segmentů se spícím úžlabním očkem, aplikaci jedu mitotického vřeténka (kolchicin nebo oryzalin) a kultivaci ovlivněných nodálních segmentů k dosažení regenerace rostlin. Vlastní metodika má tedy čtyři nedílné části.
- Kultivace donorových rostlin
- Příprava nodálních segmentů a aplikace jedů mitotického vřeténka
- Kultivace ošetřených nódů
- Hodnocení získaných regenerantů
Obr. 1 Rostliny rodu Solanum kultivované in vitro
pro přípravu nodálních segmentů
- vlevo dihaploidní S. tuberosum,
vpravo S. pinnatisectum.
2.1 Kultivace donorových rostlin
In vitro rostliny pěstujeme v klimatizační komoře s fotoperiodou 16 h/8 h světlo/tma (světelné podmínky: zářivky, typ světla – „daylight“, intenzita - 60 µmol m-2 s-1), při 22 °C. Rostliny kultivujeme na MS médiu bez hormonů (Murashige a Skoog 1962) po dobu tří týdnů. Pro jednu aplikaci pasážujeme minimálně 20 rostlin. (Obr. 1 Rostliny rodu Solanum kultivované in vitro pro přípravu nodálních segmentů - vlevo dihaploidní S. tuberosum, vpravo S. pinnatisectum.)
2.2 Příprava nodálních segmentů a aplikace jedů mitotického vřeténka
Aplikaci mitotických jedů provádí proškolená osoba, která je vybavena ochrannými prostředky (celoobličejová maska s ventilací přes filtry, plášť s dlouhými rukávy, odolné nitrilové rukavice, laboratorní kalhoty a laboratorní obuv).
Při práci je nezbytné dodržet všechna bezpečnostní opatření dle platných předpisů.
Obr. 2 Příklad přípravy nodálních segmentů
Celý proces mitotické polyploidizace probíhá ve sterilním prostředí.
Dobře rostoucí rostliny použijeme jako zdroj nodálních segmentů. Odebíráme nodální segmenty z horní části rostliny (1. nebo 2. nodální segment pod vzrostným vrcholem, Obr. 2 Příklad přípravy nodálních segmentů).
Odebrané nódy ihned pasážujeme do agarem zpevněného kultivačního média MS, a to tak, aby nevyvinuté úžlabní pupeny byly umístěny těsně nad úrovní tuhého média. Nádoby (o objemu 180 ml, s 30 ml média) s odebranými nódy kultivujeme 24 hodin za stejných podmínek jako donorové rostliny.
Poté aplikujeme pracovní roztok zvolené koncentrace mitotického jedu o objemu 15 ml přelitím přes usazené nódy (Obr. 3a Ukázka usazení nodálního segmentu do média před aplikací mitotického jedu, 3b Příklad aplikace roztoku mitotického jedu na 20 nódů). Při aplikaci oryzalinu ošetřené nódy kultivujeme za standardních podmínek, zatímco při aplikaci kolchicinu kultivace probíhá ve tmě při 22 °C. Doporučená doba působení oryzalinu je 24 nebo 48 hodin (nutno použít dvě varianty doby působení z důvodu možné odlišné reakce zvolených zdvojovaných genotypů). Doporučená doba působení kolchicinu je 24 hodin.
Obr. 3a Ukázka usazení nodálního
segmentu do média před
aplikací mitotického jedu
Po uplynutí této doby příslušný roztok mitotického jedu opatrně slijeme, tak aby nedošlo k porušení agarového kultivačního média, kde byly nódy vysazeny.
Po aplikaci mitotického jedu nódy promyjeme. Do kultivační nádoby nalijeme sterilní destilovanou vodu a po chvilce opatrně slijeme. Postup promývání opakujeme ještě dvakrát.
2.3 Kultivace ošetřených nodálních segmentů
Ošetřené promyté nódy vyjmeme pinzetou z kultivační nádoby a na sterilní Petriho misce seřízneme zahnědlé konce stonků. Takto připravené nódy ihned pasážujeme na nové agarem zpevněné MS médium a dále kultivujeme za standardních podmínek.
Po 10 dnech nódy přepasážujeme na nové MS médium. Případné zahnědlé konce seřízneme.
V závislosti na genotypu se postupně začnou vyvíjet úžlabní pupeny. Jakmile narostou do velikosti 0,3-0,4 cm, je nutné je oddělit od původního stonku a vysadit na čerstvé MS médium.
Po zakořenění a ve velikosti 2-3 cm je možné rostliny klonovat do dvojic za účelem zjištění ploidie.
Obr. 3b Příklad aplikace roztoku
mitotického jedu na 20 nódů
3 Použité médium, roztoky a jejich příprava
3.1
- Murashige & Skoog médium
| MS (Duchefa Biochemie) |
4,4 g |
| sacharóza |
30 g |
| agar |
8 g |
MS a sacharózu rozpustíme v 490 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a doplníme na objem 500 ml destilovanou vodou. Agar rozpustíme v 400 ml destilované vody a rozvaříme v mikrovlnné troubě nebo ve vodní lázni, doplníme na konečný objem (500 ml). Oba roztoky spojíme a promícháme a rozlejeme do kultivačních nádob (do výšky 1 – 2 cm) a zavíčkujeme. Nádoby s médiem sterilizujeme autoklávováním při 121 °C 20 min.
3.2
Přípravu roztoků mitotických jedů provádí proškolená osoba, která je vybavena ochrannými prostředky (celoobličejová maska s ventilací přes filtry, plášť s dlouhými rukávy, odolné nitrilové rukavice, laboratorní kalhoty a laboratorní obuv).
- Zásobní roztok oryzalinu (10 mM)
| Oryzalin |
0,0346 g |
| DMSO |
10 ml |
Navážku oryzalinu rozpustíme v DMSO (dimethylsulfoxid) ve sterilní nádobě. DMSO působí sterilizačně, proto odpadá sterilizace filtrací.
- Pracovní roztok oryzalinu (25 µM a 30 µM)
Zásobní roztok se doplní sterilní destilovanou vodou na požadovaný objem.
25 µM roztok: 250 µl zásobního roztoku doplníme na objem 100 ml
30 µM roztok: 350 µl zásobního roztoku doplníme na objem 100 ml
- Pracovní roztok kolchicinu (3,5 mM)
Navážku kolchicinu rozpustíme v malém objemu 96% etanolu, doplníme destilovanou vodou do objemu 100 ml a provedeme studenou sterilizaci přes mikrofiltr 0,22 µm.
4 Hodnocení regenerantů
U získaných regenerantů je třeba ověřit ploidii. Nepřímo lze ploidii zjišťovat pomocí počtu chloroplastů ve svěracích buňkách průduchů (Frček 1985). Přímo pak počítáním chromozomů v buňkách pomocí roztlaků kořenových špiček (Zlesák a kol. 2005). Obě výše zmíněné metody jsou velmi náročné u rostlin in vitro. Pro hodnocení ploidie je nejvhodnější a vysoce spolehlivé použít průtokovou cytometrii (http://lmcc.ieb.cz/book/flow-cytometry).
5 Literatura
- Cardi T, Ambrosio FD, Consoli D, Puite KJ, Ramulu KS (1993) Production of somatic hybrids between frost-tolerant Solanum commersonii and S. tuberosum: characterization of hybrid plants.Theor Appl Genet 87: 193-200
- Carputo D, Barone A, Cardi T, Sebastano A, Frusciante L, Peloquin SJ (1997) Endosperm balance number manipulation for direct in vivo germplasm introgression to potato from a sexually isolated relative (Solanum commersonii Dun.). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94 (22): 12013-12017
- de Carvalho JFRP, de Carvalho CR, Otoni WC (2005) In vitro induction of polyploidy in annatto (Bixa orellana). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 69-75
- Doležel J, Lucretti S, Schubert I (1994) Plant chromosome analysis and sorting by flow cytometry. Crit Rev Plant Sci 13(3): 275–309
- Eeckhaut TGR, Werbrouck SPO, Leus LWH, Van Bockstaele EJ, Debergh PC (2004) Chemically induced polyploidization in Spathiphyllum wallisii Regel through somatic embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78: 241-246
- Escadón AS, Hagiwara JC, Alderete LM (2006) A new variety of Bacopa monnieri obtained by in vitro polyploidization. Electronic J Biotechnology 9(3): 181–186
- Frček J (1985) Využití polyploidizace ve šlechtění brambor. Sborník ÚVTIZ – Genetika a šlechtění 21 (4) I-IV
- Hancock J (1997) The colchicine story. Hort Science 32: 1011–1012
- Hansen J, Andersen S (1996) In vitro chromosome doubling potential of colchicine, oryzalin, trifluralin and APM in Brassica napus microspore culture. Euphytica 88: 159-164
- Hansen J, Gertz A, Joersbo M, Andersen S (2000) Chromosome doubling in vitro with amiprophos-methyl in Beta vulgaris ovule culture. Acta Agr Scand B-S P 50: 89–95
- Helgeson JP, Haberlach GT (1999) Somatic hybrids of Solanum tuberosum and related specie. In: Altman A, Ziv M, Izhar S (Eds.): Plant biotechnology and in vitro biology in the 21st century, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht: 151-154
- Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497
- Tai GCC, Xiong X (2005) Ploidy manipulation – examination of gene action and method of gene mapping. In: Razdan MK, Mattoo AK (Eds.): Genetic improvement of Solanaceuos crops Vol 1: Potato, Science Publisher Inc., Enfield, NH, USA: 143-164
- Tuyl van J, Meijer H, Diën van M (1992) The use of oryzalin as an alternative for colchicine in vitro chromosome doubling of Lilium and Nerine. Acta Hort 325: 625-630
- Zlesak DC, Thill CA, Anderson NO (2005) Trifluralin-mediated polyploidization of Rosa chinensis minima (Sims) Voss seedlings. Euphytica 141: 281–290